A coloração de Gram, ou simplesmente Gram, é uma técnica rápida e simples que tem como objetivo diferenciar as bactérias de acordo com as características de sua parede celular após exposição a diferentes corantes e soluções.
Assim, por meio da coloração de Gram é possível verificar, além da forma da bactéria, a cor que adquirem, sendo esse resultado importante para sejam definidas outras estratégias de identificação da espécie bacteriana e para que o médico indique um tratamento preventivo de acordo com as características observadas microscopicamente.
A coloração de Gram é normalmente feita como rotina no laboratório e faz parte do exame de bacterioscopia. Entenda o que é a bacterioscopia e como é feita.
Existem, porém, algumas particularidades entre as bactérias e a fim de diferenciá-las foi criado o método chamado GRAM.
Chama-se coloração de Gram o método de coloração utilizado para diferenciar espécies bacterianas em dois grupos, bactérias gram-positivas e gram-negativas.
Entre os fatores que irão diferenciar gram-positivos de gram-negativos, estão a coloração das bactérias, a composição e propriedades químicas e físicas das paredes celulares.
Christiam Gram notou que as bactérias podiam ser coradas de azul ou vermelho devido à precipitação do cristal violeta com lugol no interior do citoplasma da célula.
Os organismos Gram-positivos possuem uma parede celular grossa envolvendo a membrana citoplasmática que é composta por peptideoglicanos e ácidos teicoico.
Imagem 2 – Estrutura da parede celular – Bactéria Gram Positiva
Os organismos Gram-negativos possuem uma parede celular mais fina que é envolvida por outra membrana externa, portanto os gram-negativos possuem 2 membranas, a externa difere da interna e contém moléculas de lipopolissacarideos.
Imagem 3 – Estrutura da parede celular – Bactéria Gram Negativa
Exemplos de bactérias Gram-positivas
Bacillus, Nocardia, Clostridium, Propionibacterium, Actinomyces, Enterococcus, Cornyebacterium, Listeria, Lactobacillus, Gardnerella, Mycoplasma, Staphylococcus, Streptomyces, Streptococcus.
Exemplos de bactérias Gram-negativas
Escherichia, Helicobcater, Haemophilus, Neisseria, Klebsiella, Enterobacter, Chlamydia, Pseudomonas, Salmonella, Shigella, Vibrio, Treponema
Por que é importante saber se a bactéria é gram-positiva ou negativa?
É o tipo de parede e portanto, a definição se a bactéria é gram-negativa ou gram-positiva que vai definir a eficácia dos agentes físicos e químicos utilizados para eliminar, controlar ou aumentar o crescimento das bactérias conforme a necessidade. Em food safety, geralmente queremos eliminar ou reduzir as bactérias a quantidades aceitáveis. Mesmo que nem todas possam ser diferenciadas pela coloração de Gram, com certeza a metodologia tem grande aplicação para food safety.
A técnica de coloração das bactérias ajuda a reconhecer as características de cada caso de infecção e determinar os tratamentos mais convenientes. Cerca de 90 a 95% das bactérias Gram-negativas são patogênicas e muitas Gram-positivas são não patogênicas e algumas, inclusive, são úteis. As paredes mais complexas das bactérias Gram-negativas as tornam mais resistentes e dificultam que os antibióticos e outros medicamentos adentrem em seu interior. Além disso, as bactérias Gram-negativas geralmente são mais ameaçadoras do que as Gram-positivas por terem uma maior virulência e serem ou se tornarem mais facilmente resistentes aos antibióticos. A técnica de Gram tem também uma grande importância clínica porque permite que as bactérias associadas a infecções sejam prontamente caracterizadas como Gram-positivas ou Gram-negativas, o que permite monitorar a infecção e adotar certas opções de tratamento, mesmo antes que seja feita uma cultura.
O peptideoglicano, por exemplo, é o sitio de ação da penicilina, isso explica por que os antibióticos são mais efetivos contra Strepto e Estaphilo (G+) do que contra E. coli (G-), por exemplo.
E como é feita a técnica de Gram?
Quando coloridas por um corante adequado e levadas ao microscópio, pode-se diferenciar dois tipos distintos de bactérias: as chamadas Gram-positivas e as Gram-negativas. Elas são assim chamadas porque foi o médico dinamarquês Hans Christian Joachim Gram, em 1884, quem elaborou o processo de colorir e descolorir as bactérias. Bactérias Gram-positivas são aquelas cujas paredes celulares não perdem a cor azul-arroxeada quando submetidas a um processo de descoloração depois de terem sido coloridas pela violeta de genciana. As que assumem um tom róseo-avermelhado quando submetidas ao mesmo processo são ditas Gram-negativas. Christiam Gram notou que as bactérias podiam se coradas de azul ou vermelho devido a precipitação do cristal violeta com lugol no interior do citoplasma da célula.
Por que este método cora algumas bactérias em violeta e outras em vermelho?
Isso ocorre devido às diferenças de estruturas químicas da superfície bacteriana e da composição da parede celular. As bactérias Gram-negativas contêm uma concentração mais elevada de lipídeos, quando comparadas com as Gram-positivas; suas paredes são, também, mais finas do que as paredes celulares de bactérias Gram-positivas. Durante o processo de coloração, o tratamento com álcool-cetona extrai os lipídeos, resultando em uma permeabilidade aumentada da parede celular das bactérias Gram-negativas. Assim, o complexo cristal violeta pode ser retirado e as bactérias Gram-negativas são descoradas. A parede celular das bactérias Gram-positivas, em virtude de sua composição diferente (menor conteúdo de lipídeos), torna-se desidratada durante o tratamento com álcool-cetona reduzindo a permeabilidade e portanto, o complexo cristal violeta não pode ser extraído.
Passo a passo resumido da metodologia de Gram
- Cubra o esfregaço com violeta-de-metila e logo após deixe por aproximadamente 15 segundos;
- Adicione igual quantidade de água sobre a lâmina coberta com violeta-de-metila e então deixe agir por mais 45 segundos;
- Escorra o corante e lave em um filete de água corrente; cubra a lâmina com lugol diluído (1/20) e deixe agir por aproximadamente 1 minuto;
- Escorra o lugol e lave em um filete de água corrente;
- Adicione álcool etílico (99,5º GL) sobre a lâmina, descorando-a, até que não desprenda mais corante;
- Lave em um filete de água corrente;
- Cubra a lâmina com safranina e deixe agir por aproximadamente 30 segundos;
- Lave em um filete de água corrente;
- Deixe secar ao ar livre, ou seque suavemente com o auxílio de um papel de filtro limpo;
- Visualize no microscópio. Logo após leia em objetiva de imersão (100 X).
Referências:
- ABCMED, 2014. Bactérias Gram-positivas e Gram-negativas: o que são? Como é a técnica de Gram? Quais as vantagens de diferenciar as bactérias Gram-negativas e Gram-positivas?. Disponível em: <//www.abc.med.br/p/587007/bacterias-gram-positivas-e-gram-negativas-o-que-sao-como-e-a-tecnica-de-gram-quais-as-vantagens-de-diferenciar-as-bacterias-gram-negativas-e-gram-positivas.htm>. Acesso em: 3 fev. 2020.
- //www.infoescola.com/microbiologia/bacterias-gram-positivas-e-gram-negativas/
- Ministério da Saúde. Técnica de Coloração de GRAM
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Juliana Barbosa é Médica Veterinária, Mestre e Doutora em Engenheira de Alimentos pela URI Erechim, RS e especialista em Controle de Qualidade e Inspeção de Alimentos. Atuou em indústrias e Universidades nas áreas de Garantia da Qualidade e Inspeção de Alimentos. Administradora da página qualidade de alimentos no Facebook e Instagram.