REVIEW ARTICLE
Papel das sinapses elétricas em crises epilépticas
The role of eletrical synapses in epileptic seizures
Raquel Araujo Do Val-da Silva; Graziela Lima Bachiega-Salviano; Ana Claudia Zanetti; Rodrigo Neves Romcy-Pereira; Tonicarlo Rodrigues Velasco; João Pereira Leite
Depto. Neurociências e Ciências do Comportamento, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP, SP, Brasil
Correspondência para
RESUMO
INTRODUÇÃO: No sistema nervoso central a comunicação entre neurônios se realiza através de estruturas denominadas sinapses: elétricas ou químicas. As sinapses elétricas são formadas pela aproximação das membranas plasmáticas de dois neurônios formando estruturas chamadas junções comunicantes (gap junctions, do inglês). As junções comunicantes são compostas por seis subunidades da proteína conexina de cada membrana, formando poros que comunicam o citoplasma de células adjacentes e permitem a passagem de íons e pequenas moléculas.
OBJETIVOS: A presente revisão pretende descrever e discutir os principais resultados que apontam para uma importante relação entre junções comunicantes e sincronia neuronal durante crises epilépticas.
RESULTADOS E CONCLUSÃO: Quando um neurônio é despolarizado, este tipo de comunicação permite a rápida transferência iônica entre as células, promovendo alta sincronia neuronal. Recentemente, o papel das junções comunicantes na geração e propagação de descargas epilépticas tem sido estudado através do uso de diferentes modelos experimentais in vivo, in vitro e in silico (modelos computacionais).
Unitermos: Junções comunicantes, sinapse elétrica, conexinas, crises epilépticas.
ABSTRACT
INTRODUCTION: In the central nervous system, neuronal communication is accomplished by structures called synapses: electrical or chemical. Electrical synapses are formed by the apposition of plasmatic membranes at gap junctions and the interaction of connexin subunits from two neurons. At this site, connexin complexes create intercellular pores that communicate the cytoplasm of adjacent neurons and allow free flow of ions and small molecules.
OBJECTIVE: In this review, we will present and discuss recent results showing the possible involvement of electrical synapses in the neuronal hypersynchronization during epileptic seizures.
RESULTS AND CONCLUSION: When a neuron is depolarized, ions flow very rapidly from one cell to the other promoting high neuronal synchrony. More recently, the role of gap junctions in the generation and propagation of epileptic discharges has been investigated using combined approaches of in vivo, in vitro and in silico (computational) models.
Keyword: Gap junctions, eletrical synapses, connexin and epileptic seizures
INTRODUÇÃO
As investigações sobre junções comunicantes (JC) no sistema nervoso têm uma longa história, iniciando com um primeiro estudo reportando a comunicação direta e acoplamento elétrico entre células nervosas de invertebrados.11 Este trabalho pioneiro abriu caminho para muitos outros que estabeleceram a comunicação elétrica entre neurônios, a chamada de sinapse elétrica, como distinta da neurotransmissão química.4 Subsequentemente, vários estudos demonstraram que as sinapses elétricas não estavam restritas a invertebrados, mas também podiam ser encontradas em vertebrados, incluindo os mamíferos.3
Hoje sabemos que há dois tipos de sinapses no sistema nervoso central (SNC): as sinapses elétricas e as sinapses químicas. O estudo de microscopia eletrônica das sinapses elétricas mostrou que elas são formadas pela aposição das membranas plasmáticas de dois neurônios resultando numa estrutura de adesão intercelular com separação de apenas ~3 nm. Este tipo de junção possui complexos protéicos que formam canais iônicos através de suas membranas, os conexons (Figura 1). Cada conexon é composto pela interação de duas proteínas conexinas, cada uma proveniente de um neurônio. Cada conexina, por sua vez, é formada por seis subunidades com inúmeras isoformas e pode se apresentar em dois estados: aberto ou fechado.
Assim, quando abertos, os conexons formam verdadeiros poros permeáveis a íons e pequenas moléculas. Durante esta comunicação não há intermediários químicos, fazendo que ela seja ultrarrápida com duração de apenas centésimos de milisegundo.19 Isto permite que uma população neuronal dispare em alta sincronia.7,22
O conhecimento sobre o papel das JC no SNC se expandiu devido ao uso combinado de técnicas de biologia molecular no estudo de células nervosas e gliais em cultura resultando na identificação de seus constituintes moleculares, as conexinas.2,6 Estudos através de microscopia eletrônica, imunohistoquímica, eletrofisiologia, injeção intracelular de traçadores e biologia molecular mostraram a presença de JC e expressão de conexinas em diversas regiões do SNC. Estas regiões incluem o hipotálamo, estriado, oliva inferior, hipocampo, bulbo olfatório, retina, córtex e cerebelo.26
Segundo Rouach e cols., foram detectados 8 diferentes tipos de conexinas em neurônios no SNC.25 A análise por RT-PCR do conteúdo de células individuais permitiu a detecção de RNAm que codificam diferentes isoformas de conexinas, como conexina-26, conexina-32, conexina-36 e conexina-43 em subpopulações de células corticais e hipocampais.29 A conexina-43 é mais expressa na glia, mas também está presente em neurônios da região CA1 do hipocampo.18 A expressão da conexina-36 é restrita aos neurônios, enquanto a conexina-32 e a conexina-43 são encontradas em oligodendrócitos e astrócitos, respectivamente.18,24
Recentemente, o papel das JC na geração de crise tem sido estudado com mais detalhes em modelos de epilepsia in vivo, in vitro, em simulações computacionais e em humanos. Estudos eletrofisiológicos têm implicado as JC na geração de oscilações muito rápidas (OMR) precedendo as crises. Oscilações de alta frequência (> 100 Hz) refletem uma sincronização de tempo curto da atividade elétrica neuronal. Tem sido demonstrado em cérebros epilépticos, que oscilações de alta frequência ocorrem em estágios precoces da epileptogênese e podem engatilhar a formação das redes neuronais geradoras de crises.5 Segundo Traub e cols. (2001), oscilações muito rápidas (OMR; >70 Hz) do EEG são importantes e muitas vezes podem ter um papel causal no início das crises.28 Todos estes dados apontam para uma relação importante entre JC, OMR e crises epilépticas, onde a ativação neuronal via JC poderia gerar as OMR que precedem e/ou iniciam crises epilépticas.
SINCRONIA, CRISES E JUNÇÕES COMUNICANTES
Alguns estudos indicam que as JC têm participação em crises epilépticas em seres humanos e animais.
Estudo em humanos
Estudo recente testou clinicamente a origem de OMR (>70 Hz), que muitas vezes precedem o início das crises focais, concentrando-se no papel das JC e suas implicações clínicas.28 Neste modelo foi utilizado registro de EEG subdural em crianças com displasia cortical focal com crises intratáveis. OMR foram encontradas nas crianças antes do início das crises, mas também sobrepostas a salvas de disparos ictais e interictais. Esses eventos não haviam sido registrados anteriormente, pois técnicas clássicas de registro de EEG não eram capazes de registrar sinais de alta frequência.
A partir do momento em que foi constatada a presença de OMR no início de crises em pacientes epilépticos, vários autores começaram a investigar a relação existente entre JC e crises epilépticas. Uma questão que surge é se as sinapses elétricas poderiam ser responsáveis pela indução, manutenção, e/ou controle da duração da crise, através da comunicação rápida entre neurônios neste tipo de sinapse.
Modelos animais in vivo
Utilizando modelos animais, Bragin e cols. (2002) estudaram a extensão da área de geração de oscilações de frequência de 250 a 600 Hz, (fast ripples-oscilações rápidas-OMR) em crises espontâneas de ratos tratados com o agonista glutamatérgico, ácido caínico (AC), aplicado por injeção intrahipocampal. Foi observado que existe uma área de geração espontânea e evocação de OMR no circuito córtex entorrinal-hipocampo do rato epiléptico. A área de geração de OMR parece ter grupos de neurônios altamente interconectados que possuem uma retro-alimentação inibitória de interneurônios, gerando salvas de disparos epileptiformes, levando às crises.5
O envolvimento das JC na manifestação e controle da duração das crises foi testado em modelo animal utilizando o bloqueador de canal de potássio, 4-amino-piridina (4-AP) em ratos. Neste estudo, os animais receberam 4-AP para iniciar as crises e carbenoxolona (CBX; bloqueador não específico de JC) ou trimetil-amônio (TMA, promove abertura de JC) 60 min depois. Foi observado que a CBX reduziu a duração e a amplitude das descargas eletroencefalográficas. O TMA teve efeito contrário. Estes dados sugerem que o envolvimento das JC pode ser crucial na sustentação da sincronização neuronal no foco epiléptico principal (FP), já que sua abertura ou bloqueio alterou significantemente a duração das crises.12
Em estudo recente, o mesmo modelo foi utilizado para investigar o significado funcional das JC na susceptibilidade, indução e manutenção das crises no cérebro de ratos em desenvolvimento com idade de 9 a 28 dias pós-natal (P9-28). Além disso, a possível contribuição das JC na indução da crise no cérebro normal foi investigada através da administração de CBX ou TMA, 5 min ou 10 min antes da aplicação de 4-AP, respectivamente. Foi observado que em animais mais jovens a abertura das JC induziu atividade eletrográfica rítmica e síncrona no córtex. Com a maturação cerebral, as crises tornaram-se focalizadas e periódicas, com amplitudes e frequência mais altas. As descobertas deste estudo sugerem que as JC não estão apenas envolvidas na gênese rítmica e na sincronização da atividade cortical, mas também podem ser responsáveis pela elevada epileptogenicidade do cérebro em desenvolvimento.13
Szente e cols. (2002) investigaram o papel das JC na indução e manifestação de crises induzidas por 4-AP no neocórtex de ratos. Foram avaliados registros eletroencefalográficos anteriores e posteriores às crises e também após o uso de CBX. Os registros intracelulares obtidos no local da aplicação de 4-AP revelaram atividades ictais com diferentes tipos de potenciais, os quais poderiam representar comunicação elétrica via JC. Quando a transmissão sináptica elétrica foi bloqueada com CBX, houve uma diminuição significativa da atividade ictal no foco epiléptico. Com estes resultados, os autores concluem que a comunicação elétrica via JC colabora para a sincronia neuronal durante a atividade epileptiforme do neocórtex de ratos.27
Os efeitos do bloqueio das JC nas atividades epileptiformes no modelo genético de epilepsia de ausência foram estudados por Gigout, Louvel e Pumain (2006). Através de registros de eletrocorticografia do córtex frontoparietal foi investigado o possível efeito antiepiléptico da CBX. Os dados demonstraram que a CBX reduziu a atividade locomotora por 90 min e que a intensidade das descargas ponta-onda diminuíram significantemente durante os primeiros 30 min após a CBX, o que sugere sua ação antiepiléptica e o envolvimento das JC nas crises.14
Modelos in vitro
Atualmente diversos grupos estudam a relação entre JC e crises epilépticas não apenas em modelos animais in vivo, mas também através de combinações de técnicas em cultura de células nervosas e gliais, o que expandiu o interesse nas JC no SNC e possibilitou o avanço de estudos nesta área.
O papel das JC na sincronização talamocortical foi investigado através da aplicação de 4-AP sobre fatias de cérebro de ratos com epilepsia de ausência da cepa GAERS (GAERS: Genetic Absence Epilepsy Rat from Strasbourg) e ratos não epilépticos (NER). Para testar o efeito da CBX na excitabilidade neuronal foram aplicados estímulos elétricos a cada 5 s. Nos registros, a atividade ictal pôde ser observada no córtex somatosensorial, insular e no hipocampo em ambas as cepas de ratos. Após aplicação CBX sobre as fatias, a frequência e duração cumulativa da atividade ictal diminuiu mais rapidamente nas fatias de GAERS do que nas fatias de NER. Estes resultados sugerem que os bloqueadores de JC limitam a propagação da atividade sincronizada in vitro.14
Kohling e cols., 2001 observaram, em modelo de fatia hipocampal de ratos, que drogas que bloqueiam as JC como o halotano, CBX e octano são capazes de converter descargas secundárias geradas a partir de eliminação completa de Mg+2 do banho (Mg+2-zero). Contrariamente, a alcalinização celular através de TMA gerou descargas secundárias em condições em que apenas salvas de disparos primários ocorreram. Estes dados apontam para papel chave das JC na manutenção da atividade epiléptica.17
No modelo Ca+2-zero de sincronia neural com bloqueio das sinapses químicas foram encontradas evidências de efeitos pró-convulsivos das JC.8 Os resultados mostram que manipulações que diminuem a condutância das JC, incluindo aplicação de halotano, octanol e redução do pH intracelular, também reduzem a atividade epiléptica induzida pelo Ca+2-zero.8,21 De forma oposta, as descargas epilépticas foram potencializadas pelo aumento do pH intracelular, com o uso de bicarbonato, TMA8,21,22 e cloreto de amônia.21
Perez-Velazquez e cols.(1994) estudaram, em fatias hipocampais de ratos, se haveria mudanças no acoplamento neuronal via JC durante salvas de disparos no modelo Ca+2-zero através de técnicas eletrofisiológicas e de coloração das JC. Em condições controles, em que as fatias estavam imersas em fluido cerebro-espinhal artificial, 15,1% das células piramidais se mostraram acopladas. Entretanto, no grupo Ca+2-zero esta taxa subiu para 34,2%. Esse aumento indica que há processos que aumentam o acoplamento eletrotônico como resultado direto da ausência de Ca+2 ou secundário às crises induzidas pela sua ausência.21 Quando a condutância das JC foi alterada pela acidificação ou alcalinização do banho, promovendo o bloqueio ou aumento do acoplamento eletrotônico, respectivamente, a atividade espontânea foi abolida ou aumentada, de acordo com registros eletrofisiológicos.
Para estudar a origem das OMR (>70 Hz), que geralmente precedem o início das crises focais, Traub e cols. (2001) utilizaram registros intra e extracelulares de OMR em fatias hipocampais de ratos. Com este intuito foi realizada: 1) Aplicação de TMA; 2) Aplicação de carbacol (agonista colinérgico) e 3) Aplicação de solução hipertônica de K+ na geração de atividade ictal. Foram encontradas OMR antes, durante e após as salvas de disparos epileptiformes, assim como sobrepostas às oscilações gama (30-70 Hz) quando induzidos por carbacol ou K+ hipertônico. Os autores notaram que as OMR que ocorriam em fatias hipocampais eram dependentes das JC, mas não da neurotransmissão química.28
Utilizando um modelo de baixo-magnésio para induzir crises espontâneas, Khosravani e cols. (2005), investigaram a evolução temporal das OMR através de registros de campo extracelular de cinco ou mais episódios de crise em fatias hipocampais que desenvolveram crises. Os dados demonstraram uma tendência a um aumento linear na amplitude do espectro de potência nas bandas de frequência de sub-oscilações (subripple 0-100 Hz), oscilações (ripple 100-200 Hz) e oscilações rápidas (fast ripple 200-300 Hz) durante o tempo correspondente a uma transição da fase pré-ictal para ictal. Esses padrões temporais dinâmicos das OMR demonstram distintas alterações nas atividades de oscilações e oscilações rápidas durante a transição para o início de crise. Sua caracterização poderá auxiliar na compreensão dos mecanismos celulares que iniciam as crises.16
Com o objetivo de estudar a extensão da área de geração de OMR e o papel destas nas crises do córtex epileptogênico foram realizados registros da atividade elétrica na camada granular do giro denteado, CA1 e subículo em fatias hipocampais de ratos. Foi observado OMR localizadas em áreas discretas diferentes do grupo controle que não apresentou nenhuma atividade semelhante à OMR. Posteriormente, com a aplicação de bicuculina, antagonista dos receptores de GABA(A), a área de geração de OMR se ampliou. A partir destes dados o autor inferiu que grupos de neurônios altamente interconectados são capazes de vencer o feedback inibitório dos interneurônios, resultando na geração de bursts epileptiformes, eventualmente levando a atividade de crise.5
Substâncias que provocam abertura das JC promovem uma hipersincronia neuronal semelhante aos modelos de tetanização. A tetanização repetida de 100 Hz a cada 10 minutos em fatias de córtex piriforme de ratos produz descargas epilépticas no núcleo endopiriforme.20 Em fatias hipocampais e parahipocampais, a tetanização de 60-100 Hz a cada 10 minutos produz atividade epiléptica, que pode ser bloqueada com octanol, propionato de sódio, ácido glicirretínico e CBX, o que sugere o papel das JC nas crises epilépticas.23
Simulação Computacional
Traub e cols. (2001) realizaram simulações computacionais utilizando modelos de células piramidais e interneurônios, JC entre axônios, com e sem bloqueio de sinapses químicas. Os resultados encontrados são consistentes com os dados in vivo e in vitro e indicam que as OMR, que precedem as crises, dependem das JC. Os autores sugerem, portanto, que as JC podem estar envolvidas na geração da atividade rápida que precede o início das crises, ou talvez até iniciando propriamente as crises. Dados de simulação concluem que as interações eletrotônicas são importantes tanto para sincronia neuronal como para a estabilização dos padrões de disparo em salvas, pelo fato de que mesmo acoplamentos fracos convertem picos em disparos em salva contribuindo para a hiperexcitabilidade.28
EXPRESSÃO DAS CONEXINAS NAS CRISES
Modelos animais
A expressão das conexinas-32, 43 e 36 foi analisada no foco epiléptico e na área análoga contralateral, após crises induzidas por 4-AP em ratos. Um significante aumento na expressão destas conexinas após repetidas crises foi observado tanto no foco principal quanto na área análoga contralateral. Isto poderia ser uma indicação do aumento das JC entre diferentes tipos de células (glia/glia, glia/neurônio e neurônio/neurônio) no foco epiléptico. Além disso, o aumento na expressão das conexinas após repetidas crises sugere o papel da JC na exacerbação das crises.12 Da mesma forma, Szente e cols. (2002) investigaram a expressão de conexinas no neocórtex de ratos e observaram que após a administração de 4-AP houve um aumento dos níveis de RNAm das conexinas-32 e 43 no foco ictal. Com estes resultados, os autores concluem que a comunicação elétrica via JC colabora com a sincronia neuronal na atividade epiléptica do neocórtex de ratos.27
Estudo em humanos
Recentemente vários estudos têm estabelecido que determinadas patologias e injúrias estão associadas com mudanças na expressão das conexinas e acoplamento intercelular, incluindo as doenças neurodegenerativas. Entretanto é difícil discriminar se estas modificações na expressão das conexinas são a causa ou a consequência destas. Além disso, os resultados destes estudos são esparsos e muitas vezes contraditórios.
De acordo com Perez-Velazquez e cols. (1994), os níveis de RNAm das conexinas encontram-se elevados em tecidos de pacientes epilépticos, sugerindo o envolvimento das JC nas epilepsias humanas.21
Em um estudo sobre a regulação dos níveis de conexinas-43 da JC astrocitária e sua correlação com crises epilépticas generalizadas na epilepsia do lobo temporal mesial (ELTM) foi investigado se a astrocitose ocorre na ELTM e se esta é acompanhada de um aumento na comunicação astrocitária através de uma maior regulação da proteína conexina-43. Os resultados desse estudo indicaram que na ELTM houve um aumento nos níveis de marcação imunohistoquímica da conexina-43 comparado com hipocampos controle humanos. Os autores sugerem que as JC podem ter um papel na geração de crises e que essa ampla regulação pode levar a um estado de crises generalizadas na progressão da ELTM.10
Com o objetivo avaliar se uma alteração na expressão das JC no tecido epiléptico têm papel crítico na origem e propagação de crises, Collignon e cols. (2006) compararam o nível de expressão das conexinas-32, 36 e 43 no hipocampo de pacientes com ELTM e indivíduos não epilépticos. Foi observado que pacientes epilépticos apresentam menor nível de conexina-32, porém a conexina-43 foi mais expressa em pacientes epilépticos que em indivíduos não epilépticos. Os níveis de conexina-32 permaneceram inalterados nestes pacientes quando comparados aos controles.9
Já, no estudo de Aronica e cols., sobre a expressão das conexinas-43 e 32 em epilepsia associado a tumores cerebrais e em córtex epiléptico perilesional, foi observado uma alta expressão das proteínas conexinas nos tumores de baixo grau e em reações astrocitárias peritumorais o que levam os autores a sugerirem que essas reações contribuem para as crises relacionadas com os tumores.1 Além disso, estudo em pacientes com epilepsia mioclônica juvenil forneceu evidências de associação alélica e genotípica entre este tipo de epilepsia e o alelo Cx 36 C588T (gene da conexina-36).15
CONCLUSÃO
Dados obtidos do estudo de modelos de epilepsia in vivo, in vitro, de simulação computacional e em humanos sugerem que as JC possam ter papel importante na indução, manutenção e controle da duração de crises epilépticas. Foi observado que, tanto em humanos quanto em animais, OMR podem preceder o início das crises, assim como podem ocorrer sobrepostas a salvas de disparos ictais e interictais. Além disso, drogas capazes de abrir, ou bloquear JC aumentam ou diminuem, respectivamente, a duração das crises. Portanto drogas capazes de bloquear JC, como a CBX poderiam representar um alvo apropriado para o desenvolvimento de novas drogas antiepilépticas. Por fim, alguns estudos mostram aumento na expressão de certas isoformas de conexinas após a indução de crises. Entretanto é difícil discriminar se estas alterações na expressão gênica de certas conexinas estão relacionadas à causa ou à consequência das crises. Portanto, novas pesquisas são necessárias para o entendimento de como, quando e porque mudanças na expressão das conexinas em células nervosas e, talvez em glias, podem interferir na atividade de crises epilépticas.
Correspondência para:
João Pereira Leite
Depto. Neurociências e Ciências do Comportamento
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo
Av. Bandeirantes, 3900
CEP 14049-900, Ribeirão Preto, SP, Brasil
Tel./Fax: (016)3602-2556
E-mail: <
Received Apr. 30, 2010; accepted June 25, 2010.
Correspondência para: João Pereira Leite Depto. Neurociências e Ciências do Comportamento Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Universidade de São Paulo Av. Bandeirantes, 3900 CEP 14049-900, Ribeirão Preto, SP, Brasil Tel./Fax: (016)3602-2556 E-mail: < >